Digest�o �cida de comida para beb�s com Multiwave 5000 para determina��o de oligoelementos com an�lise ICP-MS

Dado que a relação entre a ingestão de alimentos e o peso corporal é significativamente mais elevada do que posteriormente, os bebés e as crianças pequenas são mais vulneráveis aos efeitos das impurezas alimentares prejudiciais. Portanto, a legislação considera que este grupo populacional merece ser especificamente protegido.

Assim, os potenciais contaminantes provenientes do cultivo ou do processamento contínuo são forçados a ser reduzidos a níveis significativamente mais baixos em comparação com outros produtos alimentares.

Atualmente, a título de exemplo, a Lei de Segurança Alimentar para Bebés de 2021 está em avaliação no Congresso dos EUA, visando limites baixos de arsénico, cádmio, chumbo e mercúrio inorgânicos para crianças até aos 36 meses de idade:

- Arsénico inorgânico: 10 ppb (15 ppb para cereais)

- Cádmio, chumbo: 5 ppb (10 ppb para cereais)

- Mercúrio: 2 ppb

A Food and Drug Administration (FDA) revisará periodicamente e, se necessário, reduzirá novamente esses níveis e estabelecerá adicionalmente outros elementos tóxicos após a inspeção de dados relevantes de saúde e dietéticos.
Os níveis de acção iniciais indicados acima deverão ser alcançados no prazo de um ano após a data de promulgação. Paralelamente à avaliação da Lei de Segurança Alimentar para Bebés, a FDA já segue o “plano de ação Mais Perto do Zero” com o objetivo de reduzir ao mínimo possível a exposição alimentar a contaminantes.

Estes desenvolvimentos legislativos sobre a protecção das crianças pequenas representam um grande desafio não só para a agricultura e a indústria alimentar relacionadas, mas também para o desempenho e a qualidade dos métodos analíticos e equipamentos relacionados aplicados em laboratórios de controlo.

Além da demanda por instrumentos de medição para garantir limites de quantificação extremamente baixos, a preparação prévia da amostra também desempenha um papel importante para atender aos altos requisitos para a detecção de tais concentrações baixas de forma reprodutível e correta.

A mais alta pureza dos vasos de digestão e dos ácidos utilizados são tão importantes quanto as condições de digestão, permitindo a maior quantidade possível de amostra junto com a menor quantidade possível de ácido, a fim de manter as interferências no mínimo.

A seguir descrevemos a digestão bem-sucedida de oito amostras representativas de alimentos para bebês e crianças pequenas no Multiwave 5000 com vasos HVT50. A verificação do método é feita por análise quantitativa de elementos de duas amostras enriquecidas por ICP-MS, utilizando um produto seco e um produto com maior teor de água.

Instrumentação
As digestões foram realizadas em Multiwave 5000 equipado com acessório agitador magnético e Rotor 24HVT50 aplicando barras de agitação padrão 4,5 x 15 mm.

A moagem e homogeneização foram feitas em moinho de bolas aplicando potes de PTFE de 50 mL e bolas de ágata de 10 mm.

A análise quantitativa de arsênio, cádmio, chumbo e mercúrio foi realizada em ICP-MS, Agilent 7900.

3 Experiência

3.1 Amostras
Foram selecionadas oito amostras diferentes, abrangendo diversas composições, desde leite infantil pronto para uso com alto teor de água, passando por diferentes tipos de purês, até amostras secas, como bolachas de arroz e milho, bem como grãos em pó para preparar um mingau de aveia.

Como verificação prévia do sistema, um material de referência foi digerido e medido nas mesmas condições:

- Folhas de Espinafre NIST 1570a (material de referência)

3.2 Reagentes

Todos os ácidos foram utilizados concentrados e em grau sub-fervido.

- Ácido nítrico (HNO3, 65%)

- Ácido clorídrico (HCl, 32%)

- Água deionizada (grau mili-Q)

- Isopropanol (grau LC-MS)

3.3 Procedimento

Todo o procedimento de digestão foi realizado de acordo com a FDA 4.7 “Determinação Espectrométrica de Massa de Plasma Acoplada Indutivamente de Arsênico, Cádmio, Cromo, Chumbo, Mercúrio e Outros Elementos em Alimentos usando Digestão Assistida por Microondas”. Em contraste com a seção “Procedimento de digestão usando recipientes convencionais fechados ou com ventilação automática” no método 4.7, o volume de ácido nítrico e o volume de diluição foram reduzidos para garantir concentrações mais altas de elementos nas soluções de medição finais. Além disso, o H2O2 foi omitido, pois para as presentes matrizes de amostra não melhora a qualidade da digestão. Além disso, a temperatura de digestão foi reduzida de 200 para 180 °C, a temperatura padrão para amostras de alimentos em recipientes HVT.

Para verificar estas condições adaptadas, o material de referência padrão NIST1570a foi adicionalmente digerido e medido.

3.3.1 Preparação
Antes da pesagem, foi realizada uma operação de limpeza (ácido nítrico semiconcentrado, 10 min de rampa até 180°C/10 min de espera) e depois cada recipiente foi enxaguado com água deionizada. Para garantir uma homogeneização adequada, as bolachas de milho e arroz foram moídas em moinho de bolas (25 Hz, 3 min) antes da pesagem.

As amostras foram pesadas em recipientes de digestão de 50 mL, evitando cuidadosamente manchar a área de vedação com material de amostra. Após adicionar a solução padrão interna e o ácido nítrico (ver Tabela 2) e uma barra de agitação, os recipientes foram fechados e inseridos no rotor para aplicar o programa de digestão mencionado em 3.3.2.

Inicialmente foi realizada uma corrida de digestão com todos os 8 produtos e o padrão de referência para a posterior determinação das concentrações de arsênico total, cádmio, chumbo e mercúrio nas amostras não enriquecidas.

As duas amostras com as contaminações básicas mais baixas (hóstias de milho como “amostra seca” representativa e purê de frutas como amostra com maior teor de água; “amostra úmida”) foram então enriquecidas:

Fruit puree:

70 and 100 μl of a solution containing 100 ppb arsenic, 50 ppb cadmium and lead and 20 ppb mercury were added to individual vessels after weighing but before digestion to end up with spiking concentrations of 70 and 100 % of the limits mentioned in the Baby Food Safety Act (10 ppb arsenic, 5 ppb cadmium and lead and 2 ppb mercury).

Corn wafers:

70 and 100 μl of a solution containing 50 ppb arsenic and lead, 25 ppb cadmium and 10 ppb mercury were added corresponding to spiking concentrations of 70 and 100 % of the limits. Only for lead a higher spiking level corresponding to the 10 ppb limit for cereals was chosen as the concentration of the unspiked sample in the screening experiment was already at around 20 ppb.

For the determination of the recovery rates both products were prepared three times unspiked and spiked.

3.3.2 Programa Temperatura
O método padrão “Food” da biblioteca de métodos do Multiwave 5000 foi utilizado aplicando o modo de controle de temperatura “média” e um limite de temperatura de 200 °C.

3.3.3 Medições

Após a digestão, 0,2 mL de HCl foram adicionados ao recipiente de digestão para a estabilização do Hg. Em seguida, a solução foi transferida quantitativamente para um tubo de amostra de 50 mL e cheio até 20 mL com água deionizada.

5 mL desta solução foram transferidos para um frasco de amostrador automático e 200 μL de isopropanol foram adicionados para equalizar as sensibilidades ao arsênico e evitar o aumento do arsênico no ICP-MS devido ao conteúdo de carbono residual potencialmente remanescente após a digestão.

O arsénio foi determinado como arsénico total e não como arsénico inorgânico, conforme mencionado na Lei de Segurança Alimentar para Bebés, uma vez que isto teria exigido um procedimento de especiação.

A determinação de todos os elementos no ICP-MS foi realizada com hélio como gás de colisão. Como opção alternativa para compensar o aumento de arsênico, o arsênio foi medido adicionalmente com adição de Ar/CO2 ao gás nebulizador.

4. Resultados e Discussão

4.1 Dados

4.2 Resultados
Todas as soluções de digestão estavam claras. Com exceção do purê de carne bovina, que apresentou coloração levemente amarelada, todas as demais amostras com alto teor de água apresentaram-se incolores. As amostras secas eram um pouco mais intensamente amareladas.

4.2.1 Resultados Recuperados

Os valores absolutos de arsênico para NIST 1570a medidos após a adição de isopropanol pós-digestão para compensar o aumento de arsênico (ver 3.3.3 Medição) são na verdade mais baixos em comparação com os valores não compensados (sem adição de isopropanol) e também levam a uma melhor recuperação de 102% em vez de 123% (ver Tabela 3 e Figura 6).

Como as concentrações de arsênico do purê de frutas e das bolachas de milho são significativamente mais baixas em comparação com o NIST 1570a, as diferenças dos valores não compensados e compensados também são muito mais baixas para essas amostras e já estão na faixa da incerteza de medição do sistema. No entanto, todas as seguintes concentrações de arsénio mencionadas para puré de fruta e bolachas de milho referem-se apenas à medição “compensada por isopropanol”.

A adição de isopropanol à solução de digestão ácida leva à geração de gás ativo. Possíveis influências, por ex. a mudança nas intensidades do detector é de fato compensada pelo uso de um padrão interno, mas ainda assim impede a medição do ICP-MS. Alternativamente, o aumento do arsênico pelo carbono residual restante após a digestão pode ser compensado pela adição direta de isopropanol através do sistema de introdução de amostras do ICP-MS (conforme mencionado no FDA 4.7). No entanto, isto provoca uma diluição adicional da amostra, resultando novamente em limites de quantificação mais elevados. Outra opção de compensação é adicionar uma mistura de 1% de CO2 em Ar ao fluxo de gás Ar do nebulizador. Esta opção também foi aplicada em paralelo neste estudo, levando a taxas de recuperação um pouco mais baixas. O objetivo de todas as três opções é aumentar significativamente o teor de carbono nas soluções padrão e de amostra em relação a algum carbono residual potencial na amostra para equalizar as sensibilidades ao arsênico.

Todas as taxas de recuperação para cada elemento, e mesmo para o arsênico, mesmo independentemente do método de compensação, estão dentro da faixa de 80 a 120%, exigida no método 4.7 da FDA.

A recuperação mais baixa situa-se em 99,0% (cádmio em puré de fruta) e a mais elevada em 114% (mercúrio em bolachas de milho) e todos os desvios padrão relativos situam-se abaixo de 5%.

4.2.2 Limites de qualificação

Os LOQs foram determinados em níveis em torno de 2 ppt para cádmio, 10 ppt para arsênico, 20 ppt para mercúrio e 50 ppt para chumbo na solução de medição final. Considerando uma diluição final de 20 mL para medição, esses valores correspondem a 0,08 ppb de cádmio, 0,4 ppb de arsênico, 0,8 ppb de mercúrio e 2 ppb de chumbo em pesos de amostra de 0,5 g (amostras secas) e 0,04 ppb de cádmio, 0,2 ppb de arsênico, 0,4 ppb mercúrio e 1 ppb de chumbo em amostras aplicando 1 g para digestão (amostras úmidas).

As boas taxas de recuperação, bem como os baixos limites de quantificação (que também se baseiam na elevada pureza dos vasos de digestão) permitem não só cumprir os limites propostos pela Lei de Segurança Alimentar para Bebés, mas também oferecem a opção de medir níveis muito mais baixos. o que pelo menos já foi mencionado como um plano a ser seguido pela FDA (plano mais próximo do zero).

Multiwave 5000 com recipientes HVT50 é a solução perfeita para uma digestão rápida e completa de qualquer tipo de produto alimentar para bebês e crianças pequenas. Graças à tecnologia SmartVent, amostras de peso elevado de diferentes amostras podem ser digeridas em uma única execução devido à liberação segura da sobrepressão. Todas as nove amostras foram totalmente digeridas e taxas de recuperação perfeitas (entre 99 e 114%) e desvios padrão relativos (≤ 4,3%) foram alcançadas para duas amostras enriquecidas (1 g de purê de frutas como exemplo de úmido e 0,5 g de bolachas de milho como representativo para amostras secas) nos limites propostos pela Lei de Segurança Alimentar para Bebês para arsênico, cádmio, mercúrio e chumbo e até abaixo. Para a medição do arsénio, recomenda-se a aplicação de uma das três opções de compensação mencionadas para reduzir o potencial aumento com base no carbono residual na amostra, embora este efeito só seja pronunciado de forma relevante para matrizes com elevado teor de carbono e valores absolutos de arsénio mais elevados.

O método aplicado não só é adequado para digerir as amostras mencionadas, mas pode ser utilizado para qualquer tipo de produto alimentar para bebés, podendo o peso da amostra ser adaptado em conformidade.

Além disso, o método também pode ser aplicado no Multiwave GO Plus com seu Rotor 12HVT50.

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