Utilização de TLC, HPTLC e HPTLC-MS durante os processos de produção e purificação de ingredientes ativos e suas impurezas
Introdução
A Servier, um grupo farmacêutico internacional independente, está empenhada no progresso terapêutico em benefício dos doentes.
O seu objetivo é acelerar o desenvolvimento de novas moléculas para lançar uma nova entidade molecular no mercado a cada 3 anos, particularmente na área da oncologia. A cromatografia preparativa é, portanto, um método de eleição em I&D para fornecer produtos puros para os primeiros estudos farmacológicos, toxicológicos e clínicos num tempo muito curto. Esta técnica permite ainda isolar impurezas presentes em baixos níveis em ingredientes ativos cuja estrutura complexa não permite uma síntese rápida e fornecer um lote dentro dos prazos estabelecidos para estudos toxicológicos.
Cerca de 75% das purificações na Oril Industrie são realizadas com sílica gel. As condições necessárias para uma purificação eficiente são determinadas por CCD. Em seguida, o progresso da purificação por cromatografia em coluna preparativa é verificado por HPTLC. Vinte frações podem ser analisadas numa hora. A CCD/HPTLC é o método de eleição devido à sua simplicidade, rapidez e à escalabilidade bem-sucedida da CCD para separações preparativas. O HPTLC-MS realizado previamente permite atingir a molécula procurada em misturas muitas vezes muito complexas.
Preparação da amostra
O produto bruto (0,05 g) é dissolvido em 5,0 mL de acetato de etilo.
Camada do cromatograma
Para o desenvolvimento do método (otimização das condições de purificação), são utilizadas placas de CCD de sílica gel 60 F254 (Merck), com 20 x 5 cm, enquanto a quantificação e o acoplamento à espectrometria de massas são realizados em placas de HPTLC de sílica gel 60 F254 (Merck), com 20 x 10 cm.
Aplicação da amostra
As amostras são aplicadas em bandas com o Amostrador Automático de CCD (ATS 4), com duas pistas para CCD e até 20 pistas para HPTLC, comprimento de banda de 8,0 mm e volumes de amostra de 1,0 a 15,0 μL.
Cromatografia
As placas são reveladas numa câmara Twin Trough de 20 x 20 cm (TLC) ou 20 x 10 cm (HPTLC) com saturação da câmara (com papel de filtro) durante 20 min com diferentes solventes de revelação a uma distância de separação de 100 mm (a partir do bordo inferior) para TLC e 50 mm para HPTLC, seguida de secagem em corrente de ar frio durante 5 min.
Documentação
As imagens das placas são captadas com o Visualizador TLC a UV 254 nm e luz branca.
Espectrometria de massas
As zonas são eluídas com a Interface TLC-MS (cabeça de eluição oval) a um caudal de 0,2 mL/min com metanol-água 1:1 (V/V) num Q-TOF-MS (Xevo® G2-S QTof, Waters), operando em modo de ionização positiva (m/z 50-1200).
Resultados e discussão
O objetivo deste estudo foi isolar uma quantidade suficiente de uma impureza presente a um teor de 0,35% num lote de um intermediário num produto em desenvolvimento. O objetivo foi confirmar a sua estrutura e realizar testes toxicológicos. A natureza desta impureza foi previamente determinada por LC-MS. Como a sua estrutura é complexa, uma síntese seria muito demorada. As condições utilizadas em RP-HPLC são demasiado complexas para a transferência directa para cromatografia preparativa (fase estacionária dispendiosa). A fase móvel utilizada foi água + 0,1% de ácido metanossulfónico e acetonitrila + 0,1% de ácido metanossulfónico, que é demasiado complexa para o isolamento após cromatografia preparativa.
